این سایت در حال حاضر پشتیبانی نمی شود و امکان دارد داده های نشریات بروز نباشند
پژوهش‌های آسیب‌ شناسی زیستی، جلد ۱۹، شماره ۲، صفحات ۳۹-۵۱
عنوان فارسی طراحی، کلونینگ و بررسی بیان ژن NP در وکتور دوسیسترونی واجد ژن IL-۱۸ موشی با هدف استفاده در مطالعات واکسن آنفلوانزا
چکیده فارسی مقاله مقدمه: در حال حاضر واکسیناسیون مهمترین استراتژی در کاهش آمار مبتلایان و مرگ و میر سالیانه ناشی از آنفلوانزا فصلی تلقی می گردد. بر خلاف آنتی‌ژنهای سطحی مورد استفاده در ترکیب واکسن‌های موجود، پروتئین های داخلی ساختاری و غیر ساختاری ویروس آنفلوانزا به خوبی حفاظت شده هستند. با توجه به سطح حفاظت شدگی نسبتا بالای نوکلئوپروتئین ویروس آنفلوانزا و قابلیت ادجوانتی IL-18 در تحریک پاسخ‌های ایمنی و شیفت به Th1، این مطالعه در صدد ساخت یک پلاسمید دوسیسترونی با قابلیت بیان ژن‌های NP و IL-18 موشی بود تا در صورت نیل به این هدف به عنوان یک کاندید واکسن قابلیت ایمنی‌زایی آن در مطالعات بعدی مورد ارزیابی قرار گیرد. مواد و روش‌ها: در مرحله اول RNA ژنومی ویروس آنفلوانزا تیپA سویه H1N1/ PR8 استخراج شد و پس از تولید cDNA، توالی ژن کد کننده‌ی NP با استفاده از پرایمر اختصاصی ژن و با روش PCR تکثیر شد. در مرحله‌ی بعد ژن NP در وکتور کلونینگ pJET1.2/blunt همسانه‌سازی شد. پس از تایید صحت کلونینگ ژن در وکتور pJET1.2/blunt از طریق تعیین توالی، هضم آنزیمی و PCR، قطعه مزبور توسط هضم آنزیمی دو گانه خارج گردید. پلاسمید pIRES-Igk/mIL18/Fc با استفاده از آنزیمهای BstXI/NotI هضم دوگانه شد و قطعه مربوط به eGFP خارج شد. سپس فرآیند الحاق ژنNP در وکتور‌ دوسیسترونی pIRES-Igk/mIL18/Fc هضم شده با استفاده از آنزیم T4 Ligase صورت پذیرفت. محصول لیگاسیون به سویه استاندارد DH5α ترانسفورم شد و انتخاب کلونی های مثبت با استفاده از PCR colony صورت پذیرفت. به منظور بررسی صحت کلونینگ از تست PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد. در نهایت بیان ژن NP و IL-18 از سازه ژنی mIL-18-pIRES2-NP در رده سلولی BHK-21 و RAW264.7 ترانسفکت شده با پلاسمید به وسیله‌ی رنگ آمیزی ایمنوفلورسنت غیر مستقیم و الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج: نتایج PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی به صورت دو‌ جهته نشان داد که ژن NP ویروس آنفلوانزا در وکتور pIRES-Igk/mIL18/Fc به صورت موفق و در جهت درست کلون شده است. ترانسفکشن و بررسی قابلیت بیان سازه ژنی mIL-18-pIRES2-NP با استفاده از رنگ آمیزی ایمنوفلوئورسانس و الایزا بیان موفق آمیز ژنهای NP و IL-18 از mIL-18-pIRES2-NP در سلول یوکاریوتی را اثبات کرد. بحث و نتیجه گیری: نتایج بدست آمده در این تحقیق بیان موفقیت‌آمیز ژن NP و IL-18 از سازه mIL-18-pIRES2-NP را نشان داد. با توجه به اثرات ادجوانتی سایتوکاین IL-18، پلاسمید ساخته شده می تواند به عنوان یک کاندید مناسب واکسن ژنی برای پیش گیری از عفونت ناشی از ویروس آنفلوانزا در مطالعات ارزیابی ایمنولوژیک آتی مطرح گردد.
کلیدواژه‌های فارسی مقاله آنفلوانزا، واکسن ژنی، ژن NP، اینترلوکین18،
عنوان انگلیسی Design, cloning and expression assay of NP gene in a bicistronic vector harboring mice IL-18 gene: potential implications for type A influenza vaccine investigations
چکیده انگلیسی مقاله Background: Vaccination is the most effective tool for preventing influenza virus morbidity and mortality. Despite mutability of surface antigen, inner proteins of influenza virus are remarkably conserved among various strains. The high similarity of NP protein sequences among various strains of influenza type A from one side, and the potency of IL-18 molecular adjuvant in shifting immune response toward Th1 from other side, persuaded us to evaluate the possibility of cloning and expression of Influenza type A NP gene in a bicistronic vector harboring mice IL-18 gene in order to assess their immunogenic activities in a susceptible mouse model in the following study.Materials and Methods: At the beginning, the genomic RNA of Influenza virus PR8 was extracted and after the process of cDNA synthesis, the target gene encoding NP was amplified by PCR. In the next step, NP gene was cloned in the pJET1.2/blunt TA vector. The accuracy of cloned gene was confirmed by PCR, enzymatic digestion and sequencing. The pJET1.2‌-NP plasmid and pIRES-Igk/mIL18/Fc plasmids were simultaneously digested by BstXI/NotI enzymes. Digested NP fragment was inserted into pIRES-Igk/mIL18/Fc plasmid using T4 ligase. Transformation into DH5α and colony selection was done. Henceforth, gene cloning was confirmed by PCR, enzymatic double-digestion and sequencing. Eventually, by transfection of the constructed mIL-18-pIRES2-NP plasmid into BHK-21 and RAW264.7 cell lines, the expression of NP and IL-18 was assessed by Indirect Immunofluorscence and ELISA respectively.Results: Electrophoresis of PCR product, enzymatic digestion and sequencing showed that Influenza NP gene was successfully cloned into pIRES-Igk/mIL18/Fc to generate mIL-18-pIRES2-NP plasmid. The results of Indirect Immunofluorscence and ELISA indicated the successful expression of NP and mIL-18 from produced plasmid in eukaryotic cell lines. Conclusion: The results of the present study shows that the expression of NP and IL-18 genes from mIL-18-pIRES2-NP is successful.
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله Influenza, NP gene, mouse IL-18, bicistronic vector
نویسندگان مقاله مجتبی طاهری |
department of biotechnology, faculty of para medicine, guilan university of medical sciences, langroud, iran
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی گیلان (Guilan university of medical sciences)

محمد شناگری |
department of microbiology, faculty of medicine, guilan university of medical sciences, rasht, iran
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی گیلان (Guilan university of medical sciences)

ایرج نیکوکار |
department of biotechnology, faculty of para medicine, guilan university of medical sciences, langroud, iran
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی گیلان (Guilan university of medical sciences)

محمود خسروی |
department of biotechnology, faculty of para medicine, guilan university of medical sciences, langroud, iran
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی گیلان (Guilan university of medical sciences)

مهران نعمت طلب |
department of microbiology, faculty of medicine, guilan university of medical sciences, rasht, iran
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی گیلان (Guilan university of medical sciences)

نشانی اینترنتی
فایل مقاله فایلی برای مقاله ذخیره نشده است
کد مقاله (doi)
زبان مقاله منتشر شده fa
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده
برگشت به: صفحه اول پایگاه   |   نسخه مرتبط   |   نشریه مرتبط   |   فهرست نشریات