این سایت در حال حاضر پشتیبانی نمی شود و امکان دارد داده های نشریات بروز نباشند
مجله دانشکده پزشکی اصفهان، جلد ۳۲، شماره ۳۱۷، صفحات ۲۳۱۲-۲۳۲۳
عنوان فارسی ساخت و تعیین خصوصیت سلول نوترکیب T ۲۹۳HEK با بیان بالای ۳Tim
چکیده فارسی مقاله مقدمه: گلیکوپروتئین 3Tim (3T-cell immunoglobulin and mucin domain) یکی از نشانگرهای سطح سلولی سلول‌های 1Th (1T helper) است که در بسیاری از بیماری‌های مرتبط با سیستم ایمنی، تغییر بیان دارد. این مطالعه، با هدف بررسی و افزایش بیان پروتئین 3Tim در سطح سلول T293 انجام شد. روش‌ها: کاست بیانی 3Tim از روی پلاسمید 67M-2682W-EX با استفاده از پرایمرهای دارای جایگاه آنزیمی NheI و MluI تکثیر و در جایگاه‌های مربوط در پلاسمید pHygro ساب کلون شد. پلاسمید نوترکیب محتوی ژن 3Tim (3pH-Tim) پس از استخراج و خالص‌سازی، با آنزیم NheI خطی شد و در سلول‌های T293 با استفاده از روش کلسیم فسفات ترانسفکت شد. سپس سلول‌های نوترکیب T293 بیان کننده‌ی 3Tim در محیط حاوی هیگرومایسین انتخاب مثبت شدند. پس از یک ماه بر روی DNA ژنومیک کلون‌های سلولی باقی‌مانده، واکنش PCR (Polymerase chain reaction) به منظور بررسی ادغام 3cDNATim (Complementary DNA) در ژنوم سلول T293 انجام شد. همچنین میزان بیان پروتئین 3Tim در سطح سلول به روش فلوسایتومتری ارزیابی گردید. یافته‌ها: نتایج هضم آنزیمی با آنزیم‌های NheI و MluI بر روی پلاسمید 3p-H-Tim باند 2312 و 4600 جفت بازی را نشان داد که تأیید کننده‌ی صحت کلونینگ است. در واکنش PCR بر روی DNA ژنومیک، باند 1100 جفت بازی تکثیر شد که نشانه‌ی ورود ژن 3Tim در ژنوم سلول T293 می‌باشد. همچنین در فلوسایتومتری، 88 درصد سلول‌ها از نظر بیان 3Tim مثبت بودند و شدت بیان در قسمت زیادی از سلول‌ها بالا بود. نتیجه‌گیری: بیان پروتئین در سیستم‌های بیانی پروکاریوت‌ها از نظر زمان و هزینه بهتر از سیستم‌های یوکاریوتی است، اما در مورد پروتئین‌های دارای تغییرات پس از ترجمه، این سیستم بیانی جوابگو نیست. در برخی موارد ساختار فضایی طبیعی پروتئین در موقع لنگر انداختن بر سطح غشا، در تولید پروتئین‌های غشایی مانند 3Tim در سیستم‌های یوکاریوتی، حفظ نمی‌شود. در نتیجه، برای استفاده در تحقیقات تهیه‌ی آنتی‌بادی‌هایی که اپی‌توپ‌های فضایی را می‌شناسند و یا انتخاب آپتامر، مناسب نمی‌باشند. بیان پروتئین 3Tim در سطح سلول، می‌تواند ارایه دهنده‌ی پروتئین با ساختار فضایی طبیعی در پروژه‌های تولید آنتی‌بادی، نانوبادی و آپتامر باشد. واژگان کلیدی: 3T-cell immunoglobulin and mucin domain ، T293، سلول نوترکیب
کلیدواژه‌های فارسی مقاله
عنوان انگلیسی Producing Recombinant HEK293 T-cells with High Expression of T-cell Immunoglobulin and Mucin Domain-3 (Tim3) Protein
چکیده انگلیسی مقاله Background: T-cell immunoglobulin and mucin domain-3 (Tim3) is known as a marker of cell surface of T-helper-1 (Th1) cell and has a key role in many diseases with cell-mediated immunity. Over expression of Tim3 has reported in autoimmune and atopic diseases. Though, many studies done about this inhibitory help protein molecules, but yet need more research. In research project on Tim3, native protein with proper post translation modification should be provided. In this study, Tim3 was expressed on the surface of HEK293 T-cell line. Methods: Tim3 expression cassette was amplified from cDNA clone EX-W2682-M67 via polymerase chain reaction (PCR). The PCR product and pHygro plasmid were digested by NheI and MluI restriction enzymes. The linearized pHygro and digested PCR product were ligated together with T4 DNA ligase and transformed into Escherichia coli TOP 10 F'. The resulted pH-Tim3 plasmid was linearized with NheI and transfected into 293T cell line. The transfected cells were positive selected with hygromycin and their genomic DNA was extracted and PCR was done on them to amplify complementary DNA (cDNA) of Tim3. Also, protein expression levels were assessed via flow cytometry. Findings: The result of PCR on selected cells confirmed integratioin of cDNA clone of Tim3 in genomic DNA. Based on flow cytometry, about 88% of cells were expressed Tim3 sharply. Conclusion: In order to understand the role and mechanism of Tim3 protein, we need a large amount of purified native Tim3. Prokaryotic expression systems are simpler and cheaper than eukaryotic expression system, but they are not proper system for expression of proteins that modified after translation. Expression of membrane proteins like Tim3 on the surface of cell has even more native conformation in comparison with recombinant Tim3. The cells display Tim3 could be used in antibody, nanobody or aptamer production projects. In this project, we constructed a 293T cell which overexpressed Tim3 on its surface compared to untransfected ones.
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله
نویسندگان مقاله مونا مبلغ ناصری | mona mobalegh naseri
دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی و کمیته ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

حسین خان احمد | hossein khan ahmad
استادیار، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

ویدا همایونی | vida homayouni
دانشجوی دکتری، گروه ایمنی شناسی، دانشکده ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

مزدک گنجعلی خانی حاکمی | mazdak ganjali khani hakemi
استادیار، گروه ایمنی شناسی، دانشکده ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

منصور صالحی | mansour salehi
استادیار، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

ایلناز رحیم منش | ilnaz rahim manesh
دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی و کمیته ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

راضیه تقی زاده | razieh taghi zadeh
دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی و کمیته ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

مهسا کلاهدوز | mahsa kolahdooz
دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، دانشکده ی پزشکی و کمیته ی تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، اصفهان، ایران
سازمان اصلی تایید شده: دانشگاه علوم پزشکی اصفهان (Isfahan university of medical sciences)

نشانی اینترنتی http://jims.mui.ac.ir/index.php/jims/article/view/4738
فایل مقاله اشکال در دسترسی به فایل - ./files/site1/rds_journals/103/article-103-317823.pdf
کد مقاله (doi)
زبان مقاله منتشر شده fa
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده مقاله پژوهشی
برگشت به: صفحه اول پایگاه   |   نسخه مرتبط   |   نشریه مرتبط   |   فهرست نشریات