این سایت در حال حاضر پشتیبانی نمی شود و امکان دارد داده های نشریات بروز نباشند
پژوهش‌های آسیب‌ شناسی زیستی، جلد ۱۰، شماره تابستان ۸۶-، صفحات ۰-۰
عنوان فارسی طراحی روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی نسبی برای بررسی بیان ژن CD۴۰ در سلول‌های دندریتیک پس از مهار با آنتی‌سنس
چکیده فارسی مقاله هدف: سلول‌های دندریتیک در تنظیم وکنترل پاسخ‌های ایمنی نقش مهمی به عهده دارند. امروزه نظر بر این است که از این سلول‌ها در درمان بسیاری از بیماری‌ها می‌توان استفاده کرد. یکی از راه‌های ایمونوتراپی ایجاد سلول‌های دندریتیک تولروژن از طریق ممانعت از بیان مولکول‌های کمک تحریکی است.CD40 یکی از مولکول‌های کمک تحریکی بوده که با ممانعت از بیان آن از طریق روش‌هایی مانند آنتی‌سنس یا SiRNA می‌توان به این مهم (سلول‌های دندریتیک تولروژن) دست پیدا کرد. با تولید سلول‌های دندریتیکی تولروژن می‌توان افقی روشن در درمان بسیاری از بیماری‌ها ایجاد نمود و با طراحی RT-PCR کمی برای اندازه‌گیری میزان بیان می‌توان راه را برای ایجاد این سلول‌ها هموار نمود. در این تحقیق با طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزارهای مربوط و منتقل کردن آن به سلول‌های دندریتیکی با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ (Invitrogen) به سلول دندریتیک تولروژن رسیده‌ایم. مواد و روش‌ها: در این مــطالعه سـلول‌های دندریتیک از طحال موش Balb/c جـدا شد و مــیزان خلوص به وسـیله فـلوسیتومتری بر اساس نشانگر CD11Cتعیین شد. رده سلولی B‏CL1 به‌عنوان گـروه کنترل، بیان‌کننده CD40 در مـحیط کـشت FCS 10% RPMI-1640+ کـشت داده شـدند. با اســتفاده نـرم‌افــزارهای بیوانفورمــاتیک Beacon Designer و mfold and Blast آغــازگر برای ) GADPHبه عـنوان کـنترل داخـلی) و CD 40 طراحی شد، کیت RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت و با تعیین O.D280/260 و الکترفورز در آگارز مـیزان خلوص تعیین شد. در ادامه کار ابتدا PCR کیفی با استفاده از آنزیم Fast Hot Start Taq (Roche) بهینه شد و سپس بعد از ساخت cDNA با استفاده از کیت IQ sybergreen (Biorad)،RT-PCR کمی برای CD40 بهینه و در نهایت با استفاده از همین کیت منحنی استاندارد پس از تهیه رقت‌های مناسب از RNA برای CD40 و کنترل داخلی محاسبه شد. پس از طراحی آنتی‌سنس با استفاده از نرم‌افزار‌های بیوانفورماتیک با استفاده از ماده ”لیپوفکتامین 2000“ انتقال، انجام و با استفاده از RT-PCR کمی میزان کاهش بیان ژن مشخص شد. نتایج: دمای بهینه اتصال با استفاده ازشیب Real time PCR و بهترین CT و Rn∆ در 5/95 درجه سانتی‌گراد برای هر دو ژن CD40 و GADPH تعیین و همچنین دمای ذوب PCR حدود 84 درجه سانتی‌گراد مشخص شد. شیب و بازدهی واکنش PCR برای ژن‌های CD40 و GADPH با روش رقت سریال تعیین شد. با استفاده از غلظت نابرابر آغازگرها بازدهی و شیب برابری این دو ژن با دمای اتصال یکسان تعیین شد. (بازده CD40: 5/96، شیب: 408/3- ؛ بازده GADPH: 1/94، شیب: 471/3-) میزان کاهش بیان ژن پس از انتقال با آنتی‌سنس 64/1در سلول‌های دندریتیکی و در رده سلولی BCL132/1 تعیین شد. ماده منتقل شده تأثیری روی بیان ژن ندارد. بهترین زمان برای اندازه‌گیری کاهش بیان ژن CD40 48 ساعت پس از انتقال در سلول‌های دندریتیکی و رده سلولی BCL1 است. نتیجه‌گیری: در مطالعات مختلف از روش‌های متفاوتی مانند RT-PCR نیمه کمی RT-PCR کمی مطلق و RT-PCR کمی نسبی برای تعیین میزان بیان ژن‌های مختلف ازجمله CD40 استفاده شده است. بررسی‌ها در این تحقیق نشان داد که استفاده از کیت IQ–sybergreen (Biorad) و الیگومر دی‌اکسی تیمیدین برای سنتز cDNA برای رسم منحنی استاندارد ژن CD40 بسیار مناسب است (در این مورد GADPH کنترل داخلی مناسبی است) که در مقایسه با RT-PCR نیمه کمی دقیق‌تر و قابل اعتمادتر است.
کلیدواژه‌های فارسی مقاله ، سلول‌های دندریتیک
عنوان انگلیسی Designing of relative quantitative Real-Time PCR for detection of CD40 gene expression in dendritic cell after suppression with antisense
چکیده انگلیسی مقاله Objective: Dendritic cells have a critical role in control and regulation of immune responses. It is believed that these cells can be used for the treatment of many diseases. One of the methods used in immunotherapy is based on generating of tolerogenic dendritic cells through inhibition of expression costimulatory molecules. CD40 is one of the costimulatory molecules, and inhibition of expression by antisense or siRNA techniques, can generate tolerogenic dendritic cells. Generation of tolerogenic dendritic cells will be useful in the treatment of many diseases. By developing a quantitive RT-PCR for evaluation of gene expression, generation of these cells could be possible. Using proper software we designed an Antisense and transfection of dendritic cells by lipofectamine 2000 (Invitrogen) could lead us to generate tolerogenic dendritic cells. Materials and Methods: In this study dendritic cells were extracted from of Balb/c mice Spleen and the purity of this extraction was determined by flow cytometry. BCL1 cell line as a CD40 expressing control group and Wehi-164 cell line were cultured in RPMI-1640+10%FCS. Primer design for CD40 gene and house keeping gene (GADPH) was done by bioinformatic soft wares such as Beacon designer, mfold and Blast. RNasy plus mini kit (Qiagen) was used for RNA extraction and the Purity and integrity were determined by O.D at 260/280 and agarose gel electrophoresis. In the next step cDNA synthesized and quantitative RT-PCR for CD40 using IQ sybergreen (Biorad) were setup. Finally, standard curve for CD40 and internal control in different RNA concentrations were performed. After transfection with lipofectamin 2000 the amount of gene suppression were quantified by qualitative RT-PCR. Results: Using gradient real time PCR, optimum annealing temperature, Ct and ∆Rn for CD40 and GADPH were determined, annealing temperature was 59.5ºc and melting temperature was 84°c. Slope of the curve and the efficacy of PCR for CD40 and GADPH genes were quantified by serial dilution method
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله CD40,Real Time PCR,-
نویسندگان مقاله محمدحسین کریمی | Mohammad Hossein Karimi
Department of Immunology, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

زهرا سهیلا سهیلی | Zahra Soheila Soheili
Department of Biochemistry, National Center Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
گروه بیوشیمی، مرکز تحقیقات مهندسی ژنتیک و زیست فن‌آوری، تهران، ایران

علی‌اکبر پورفتح‌اله | Ali Akbar Pourfathollah
Department of Immunology, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
استاد، گروه ایمونولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

شهرام سمیعی | Shahram Samiei
Iranian Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran
مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران

سید محمد مؤذنی | Seyed Mohammad Moazzeni
Department of Immunology, School of Medical Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
گروه ایمنی‌شناسی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

زهرا عطائی | Zahra Ataee
Iranian Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran
مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران

بیتا گرامی‌زاده | Bita Geramizadeh
Transplant Research Center, Nemazi Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran
مرکز تحقیقات پیوند و ترمیم اعضا، بیمارستان نمازی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران

مهناز کواری | Mahnaz Kavari
Iranian Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran
مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران

مریم عبدالهی | Maryam Abdollahi
Iranian Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran
مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران، تهران، ایران

پدیده عبادی | Padideh Ebadi
Department of Biology, Islamic Azad University, Kazeroun Unit, Kazeroun, Iran
گروه زیست‌شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کازرون، کازرون، ایران

نشانی اینترنتی http://journals.modares.ac.ir/browse.php?a_code=A-30-1000-6789&slc_lang=fa&sid=30
فایل مقاله اشکال در دسترسی به فایل - ./files/site1/rds_journals/159/article-159-590261.pdf
کد مقاله (doi)
زبان مقاله منتشر شده fa
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده
برگشت به: صفحه اول پایگاه   |   نسخه مرتبط   |   نشریه مرتبط   |   فهرست نشریات