این سایت در حال حاضر پشتیبانی نمی شود و امکان دارد داده های نشریات بروز نباشند
مجله دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران، جلد ۷۶، شماره ۶، صفحات ۳۸۸-۳۹۵
عنوان فارسی همسانه‌سازی ژن و بیان دُمین عملکردی ترومبوپویتین به‌صورت محلول با به‌کارگیری میزبان بیانی رزتاگامی
چکیده فارسی مقاله زمینه و هدف: پروتیین ترومبوپویتین یک سایتوکین مهم ‌است که در تنظیم تکثیر سلول‌های بنیادی‌خون‌ساز و تمایز مگارکاریوسیت‌ها دخیل است. به‌دلیل مقدار اندک این پروتیین در خون، در بسیاری از مراکز بیوتکنولوژی این پروتیین به‌صورت نوترکیب تولید می‌شود. هدف از این مطالعه همسانه‌سازی و بیان ژن این پروتیین بود. روش بررسی: این مطالعه تجربی آزمایشگاهی در مرکز تحقیقات انتقال خون تهران، از مرداد 1395 تا شهریور 1396 انجام گرفته است. سلول‌های رده‌ سلولی HepG2 کشت و از آن‌ها RNA جهت الگوی سنتز cDNA استخراج شد. cDNA به‌عنوان الگوی واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای طراحی شده قرار گرفت و توالی رمزکننده‌ی دُمین (Domain) عملکردی ترومبوپویتین جداسازی و وارد پلاسمید pET32 شد. وکتور نوترکیب با استفاده از روش ختم زنجیره توالی‌یابی و سپس وکتور نوترکیب به سویه‌ی بیانی رزتاگامی تلقیح شد. القای بیان پروتیین با استفاده از مقادیر مناسب Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) انجام گرفت. باکتری بیان‌کننده تهیه شده، تحت آزمون وسترن بلات قرار گرفت. یافته‌ها: با خوانش توالی وکتور نوترکیب، حضور توالی ژن ترومبوپویتین تایید شد. القای بیان، ارزیابی پروتیین کل سلول حاکی از بیان پروتیین هدف به‌صورت محلول در فضای سیتوپلاسمی بود. جایگاه قرارگیری باندهای مربوط به توالی مورد انتظار در ژل پلی‌آکریل آمید و واکنش انجام گرفته با آنتی‌بادی‌های آنتی‌هیستگ در وسترن بلات گویای درستی بیان پروتیین هدف بود. نتیجه‌گیری: باکتری رزتاگامی توانایی بیان پروتیین نوترکیب ترومبوپویتین را به‌صورت محلول دارد. با این روش می‌توان با استفاده از سیستم پربازده باکتریایی، پروتیین نوترکیبی تولید نمود که به‌صورت انکلوزیون‌بادی نبوده و مستلزم مراحل بازپردازی نمی‌باشد.
کلیدواژه‌های فارسی مقاله سایتوکین‌ها، سلول‌های بنیادی خون‌ساز، ترومبوپویتین
عنوان انگلیسی Gene cloning and expression of soluble thrombopoietin functional domain by harnessing Rosetta-gami expression system
چکیده انگلیسی مقاله Background: Thrombopoietin (TPO) is an important cytokine that has a critical role in regulating hematopoietic stem cells (HSCs) proliferation and megakaryocyte differentiation. Because of scares amount of this protein in human plasma, in many biotechnological centers around the world, recombinant production of this protein has been carried out. This study was aiming to gene cloning and expression of recombinant thrombopoietin. Methods: This research is an experimental laboratory study carried out in Blood Transfusion Research Center, Tehran, Iran, from July 2016 to August 2017. At the beginning HepG2 cell line was cultured and RNA extraction was performed. Extracted RNA was used as template for cDNA synthesis and subsequently the synthesized cDNA was adopted to isolate TPO gene through polymerase chain reaction (PCR) reaction using designed primers. After isolating the TPO sequence from HepG2 cell line, the designated sequence was inserted into pET32 vectors. Recombinant plasmid was amplified by meriting from DH5α replicating system. The amplified plasmids were sequenced via chain termination method. Next step was transforming the recombinant plasmid into Rosetta-gami bacteria to express the recombinant protein. In order to induce protein expression, an appropriate amount of isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) was added to growth media, then bacterial lysate of expression host was prepared and assayed via polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting test. Results: After sequencing of recombinant plasmid, it was confirmed that TPO sequence has been successfully colonized in adopted vector. Subsequent to induction of recombinant protein, total cell protein analysis affirmed that recombinant protein has been expressed in its soluble form at cytoplasmic condition. Location of expected recombinant protein band on polyacrylamide gel and reaction of recombinant protein with His-tag monoclonal antibody at western blotting was asserting that expressed protein is the one of interest. Conclusion: Rosetta-gami bacteria has capability of expressing recombinant thrombopoietin in its soluble form. By harnessing this method of recombinant protein expression, it would be possible to take advantage of high throughout bacterial expression system which would not produce inclusion body and its product doesn't need further processing and refolding.
کلیدواژه‌های انگلیسی مقاله cytokines, hematopoietic stem cells, thrombopoietin
نویسندگان مقاله محمد مرادی | Mohammad Moradi
Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran.
گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران.

کامران عطاردی | Kamran Atarodi
Department of Haematology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran.
گروه هماتولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران.

مهشید محمدی‌پور | Mahshid Mohammadipour
Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran.
گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران.

کامران موسوی حسینی | Kamran Mousavi Hosseini
Department of Biotechnology, Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran.
گروه بیوتکنولوژی، مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی آموزشی و پژوهشی طب انتقال خون، تهران، ایران.

نشانی اینترنتی http://tumj.tums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3666-81&slc_lang=other&sid=1
فایل مقاله اشکال در دسترسی به فایل - ./files/site1/rds_journals/54/article-54-893512.pdf
کد مقاله (doi)
زبان مقاله منتشر شده other
موضوعات مقاله منتشر شده
نوع مقاله منتشر شده مقاله اصیل
برگشت به: صفحه اول پایگاه   |   نسخه مرتبط   |   نشریه مرتبط   |   فهرست نشریات